生物脱氮工艺由于运行成本低,二次污染小,已逐渐被应用于处理各种含氮废水。 而作为生物脱氮新技术之一的好氧反硝化,较之传统缺氧反硝化技术,不仅效率更高,而且适应性强,好氧反硝化反应过程中不受氧气抑制从而容易调控,并且使硝化反硝化同时发生在一个反应器内,可减少占地面积和建设成本,其反硝化速率比传统的缺氧条件下高,因此得到广泛的关注。 国内外学者研究发现 Alcaligenes、Pseudomonas、Bacillus等菌属具有好氧反硝化性能。

　　有机碳源作为电子供体,在异养反硝化菌代谢过程中发挥重要作用。 在污水生物处理中,碳源费用占设备运行和管理成本一半以上,因此,寻找高效低成本的碳源可以在一定程度上解决碳源成本高的问题。 很多学者研究利用农林业有机物质作为反硝化碳源如报纸、麦秆、木、棉花、玉米芯等;但是有些农林业有机物如棉花有更高的经济价值,因此使用农林业废弃物作为反硝化碳(源能在脱氮同时实现废物资源化,更具实际意义。

　　农林业废弃物是由纤维素、半纤维素、木质素组成,其复杂的三维结构阻碍微生物接近可生物利用的纤维素和半纤维素部分。 另外,使用农林业废弃物作固体碳源存在着许多问题亟待解决,如释碳速度无法控制,反硝化效率较低,需要较长的水力停留时间,容易造成填料堵塞等。 若先将农林业有机物进行预处理,从三维结构中分离纤维素和半纤维素,并进一步分解出易被微生物利用的可溶性有机物质,以水解液作碳源从而提高反硝化效率,解决固体碳源所存在的问题。

　　目前很多工业废水如石油行业含氮废水都超过 45 ℃,烟气经过除尘和脱硫后温度也一般在 50 ~ 60℃,而当前的相关生物技术的最佳温度均为常温,高温生物脱氮技术具有切实的工程应用价值。

　　本研究首次利用玉米叶作为好氧反硝化碳源,这是基于玉米叶的碳水化合物含量高而木质素含量低,因而有利于微生物利用。 先对玉米叶进行水解预处理,使水解液中富含可生物降解的可溶性有机碳,反硝化效率可进一步提高。 本研究考察以玉米叶水解液为碳源,螯台球菌( Chelatococcus daeguensis)TAD1 在 50 ℃下的好氧反硝化效率。

　　1　 材料与方法

　　1. 1　 实验菌株

　　螯台球菌(Chelatococcus. daeguensis) TAD1 是本实验室前期从广州瑞明电厂生物滴滤塔内筛选出来具有好氧反硝化特性的菌株。 TAD1 在 - 20 ℃下保存于甘油管中,实验前使用种子培养基进行活化。

　　1. 2　 培养基

　　种子培养基:蛋白胨 10. 0 g·L - 1,牛肉浸膏 5. 0 g·L - 1,氯化钠 5. 0 g·L - 1。

　　硝酸盐反硝化培养基: KH2 PO41. 5 g·L - 1, Na2HPO4 0. 8 g·L - 1, MgSO4 0. 2 g·L - 1, KNO3 0. 36 ~2. 16 g·L - 1,微量元素 2 mL,玉米叶和柠檬酸钠根据实验要求进行调整。

　　亚硝酸盐反硝化培养基: KH2 PO41. 5 g·L - 1, Na2HPO4 0. 8 g·L - 1, MgSO4 0. 2 g·L - 1, NaNO2 0. 15~ 0. 74 g·L - 1,微量元素 2 mL,玉米叶和柠檬酸钠根据实验要求进行调整。

　　微量元素溶液成分:EDTA 50. 0 g·L - 1,ZnSO4 2. 2 g·L - 1,CaCl2 5. 5 g·L - 1,MnCl2·4H2O 5. 06 g·L - 1, FeSO4·7H2O 5. 0 g·L - 1,( NH4 ) 6Mo7O2·4H2O 1. 1 g·L - 1,CuSO4·5H2O 1. 57 g·L - 1,CoCl2·6H2O 1. 61 g·L - 1。

　　1. 3　 碳源材料及其主要参数测定

　　玉米叶来源于广州市番禺区新造镇,回收后用自来水洗净,储存于4 ℃冰箱中。 前期实验得出以下预处理最优条件,将玉米叶粉碎至 10 ~ 40 目,加碱量为 0. 01 mol·L - 1,固液负荷比为 60 g·L - 1,在 40 ℃下静置 24 h,其水解液作为液体碳源供螯台球菌 TAD1 生长。 测定玉米叶水解液的化学需氧量(COD) 、还原糖、pH、NO -3 -N 和 NO -2 -N。

　　1. 4　 菌株 TAD1 分别利用玉米叶水解液、柠檬酸钠为碳源时好氧反硝化性能

　　在玉米叶水解液中加入硝酸盐反硝化培养基中除碳源以外的其他组分,在 105 ℃下高压灭菌 30 min。基于本实验室的前期研究,TAD1 脱氮的最佳 C / N 为 9,最佳碳源为柠檬酸钠;因此,在硝酸盐反硝化培养基中加入柠檬酸钠使 C / N 为 9 与玉米叶水解液进行比较,在 115 ℃下高压灭菌 20 min。

　　将 TAD1 活化后取 10 mL(即 10%体积比)菌悬液接种于含 90 mL 硝酸盐反硝化培养基的 250 mL 的锥形瓶中,于50 ℃、160 r·min - 1(此时溶解氧为7. 25 mg·L - 1)条件下培养20 h,每隔2. 5 h 取样2 mL 检测其 NO -3 -N、NO -2 -N。

　　1. 5　 培养条件对 TAD1 好氧反硝化的影响

　　将 TAD1 活化后接种于 90 mL 反硝化培养基中,于 50 ℃、160 r·min - 1条件下培养 10 h,隔一定时间测定其 NO -3 -N、NO -2 -N、OD600 。

　　1. 5. 1　 混合碳源中玉米叶水解液与柠檬酸钠比例的影响

　　玉米叶水解液与传统碳源混合可能会提高硝酸盐去除率,使处理后水质达到更高标准。 将玉米叶水解液与柠檬酸钠溶液以不同的比例混合,柠檬酸钠加入量基于 C / N 为 9,初始 NO -3 -N 为 100 mg·L - 1时,考察混合比对好氧反硝化性能的影响。

　　1. 5. 2　 初始 pH 的影响

　　前期研究探索出,玉米叶水解液被 TAD1 利用的过程中,pH 会下降再上升,偏碱性更有利于 TAD1 进行好氧反硝化,最佳初始 pH 为 8. 5。 调整初始 pH 至 7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0,考察不同 pH 对 TAD1 以混合液为碳源时好氧反硝化性能的影响。

　　1. 5. 3　 初始 NO -3 -N 的影响

　　保持玉米叶水解液浓度不变,而柠檬酸钠按 C / N 为 9 调整,使初始 NO -3 -N 浓度为 50、100、150、200、250、300 mg·L - 1,在最佳 pH 条件下考察不同初始 NO -3 -N 对 TAD1 以混合液为碳源时和以玉米叶水解液为唯一碳源时好氧反硝化性能的影响。

　　1. 5. 4　 初始 NO -2 -N 的影响

　　调整初始 NO -2 -N 浓度为 30、50、100、150 mg·L - 1,考察不同初始 NO -2 -N 对 TAD1 以混合液为碳源时和以玉米叶水解液为唯一碳源时好氧反硝化性能的影响。

　　1. 6　 分析方法

　　硝酸盐氮(NO -3 -N)测定采用酚二磺酸-紫外分光光度法,亚硝酸盐氮( NO -2 -N)测定采用 N-( 1-萘基) -乙二胺分光光度法,化学需氧量(COD)测定采用快速密闭消解法,还原糖测定采用 3,5-二硝基水杨酸分光光度比色法,OD600测定采用 721 分光光度计在光密度为 600 nm 处测定吸光度值,溶解氧测定采用YSI 型 DO 测定仪,pH 测定采用 PHS-25 pH 计。

　　2　 结果与分析

　　2. 1　 玉米叶水解液主要参数测定

　　实验对培养 24 h 后的玉米叶水解液主要参数进行测定。 玉米叶在 24 h 内释放大量 COD,浓度为4 508 mg·L - 1。 玉米叶水解液中还原糖含量先增加后减少, 24 h 时为2 530 mg·L - 1,占 COD 的56. 12% 。 加入 0. 01 mol·L - 1NaOH 时玉米叶水解液 pH 为 9. 35,pH 在水解过程中不断降低,经过 24 h后,pH 下降低至 4. 42,可能是由于玉米叶水解过程中产生有机酸,而且其水解产物糖类也会进一步分解为有机酸。 玉米叶渗出 1. 16 mg·L - 1NO -3 -N 和 0. 01 mg·L - 1NO -2 -N,不会增加明显的硝氮和亚硝氮含量。

　　2. 2　 菌株 TAD1 分别利用玉米叶水解液、柠檬酸钠为碳源时好氧反硝化性能

　　由图 1 可看出,菌株 TAD1 利用玉米叶水解液为唯一碳源生长时,硝酸盐氮在 5 h 内由 100. 25 mg·L - 1降至 20. 70 mg·L - 1,并在 10 h 内降低到 8. 20 mg·L - 1,平均反硝化速率为 9. 21 mg·( L·h) - 1。 亚硝酸氮在 5 h 达到最大值 39. 28 mg·L - 1,在 7. 5 h 后降至 0。 硝酸盐氮与亚硝酸盐氮的迅速减少可能是由于玉米叶水解液中含有多种碳源供 TAD1 利用,有助于 TAD1 迅速生长,快速去除硝酸盐氮与亚硝酸盐氮。 但是硝酸盐在 10 h 后并没有进一步并去除,脱氮率为 91. 82% 。 当柠檬酸钠为唯一碳源时,反硝化速率明显比玉米叶水解液为碳源时慢。 由于柠檬酸钠、C / N 为 9 是 TAD1 脱氮的最佳条件,进一步增加碳量并不会提高反硝化速率,因此其速率低于玉米叶水解液不是由于其含碳量较低而可能是因为 TAD1对其利用的速率低于玉米叶水解液。 NO -3 -N 在 20 h 内降至 0, NO -2 -N 在 12 h 达到最大值 40. 80mg·L - 1,在 20 h 后低于检测限。 虽然 TAD1 利用柠檬酸钠为碳源生长时,反硝化速率仅有 5. 03mg·( L·h) - 1,但随着反硝化过程的持续脱氮率可达到 100% 。 若将两者按一定比例混合作为碳源可能会同时获得高反硝化速率和脱氮率。

　　2. 3　 混合碳源中玉米叶水解液与柠檬酸钠比例的影响

　　为了进一步降低处理后的硝酸盐浓度,实验将玉米叶水解液以不同比例混合,考察不同混合比对TAD1 的好氧反硝化性能的影响,结果如图 2 所示。

　　由此可看出,随着玉米叶水解液含量增大,硝酸盐去除率先增加后减少,在混合比为 1 ∶ 4 时硝酸盐去除率达到峰值 95. 85% 。 当柠檬酸钠与玉米叶比例大于等于 1 ∶ 4 时,处理 10 h 后硝酸盐去除率均达到92% 以上,并且没有亚硝酸盐的积累,因此无须进一步增加玉米叶水解液的投入。 而当混合比低于1 ∶ 4 时有亚硝酸盐积累,并且玉米叶水解液含量越低其积累越明显;因此,将玉米叶水解液与柠檬酸钠以 1 ∶ 4 混合作为碳源供 TAD1 利用可以同时获得最优反硝化速率和脱氮率。

　　2. 4　 初始 pH 的影响

　　由图 3 可看出:随着初始 pH 的增加,硝酸盐去除率先增加后下降,在 pH 为 8. 0 时达到最大值96. 79% 。 在初始 pH 为 7. 0 ~ 9. 0 时均没有亚硝酸盐的积累。 OD600的变化趋势与硝酸盐去除率的相一致,在 pH 为 8. 0 时达到最大值 1. 555。 因为在TAD1 利用玉米叶水解液的过程中,培养基的 pH 会先下降再上升,因此在初始 pH 为 8. 0 时,更有利于TAD1 生长,从而达到更高的去除率。 值得注意的是,在 pH 为 7. 0 ~ 9. 0 时,去除率均高于 92. 5% ,说明 pH 的下降没有给好氧反硝化带来显著的负面影响。

　　2. 5　 初始 NO -

　　3 -N 的影响

　　保持玉米叶水解液含量不变而柠檬酸钠按 C / N 为9 调整,实验考察不同 NO -3 -N 对 TAD1 利用 2 种碳源的好氧反硝化性能的影响,结果如图 4 所示。

　　由图4( a)可看出,在初始 NO -3 -N 为0 ~ 250 mg·L - 1时,玉米叶水解液或混合液为碳源时硝酸盐去除率与浓度正相关,最大值分别为 97. 20%与 95. 12% 。 而当浓度为 300 mg·L - 1时,两者均下降,并且伴随着亚硝酸盐的积累,分别为 16. 05 mg·L - 1与 18. 20 mg·L - 1,这是由于随着硝酸氮浓度的增加需要相应碳源的补充才能维持高效率,或延长处理时间以达到高去除率,12 h 时以两者为碳源均不再有亚硝酸盐积累(数据在图中未给出) 。 由图 4( b)可看出,好氧反硝化效率随浓度的变化趋势与硝酸盐去除率相一致,最大值分别为 24. 30 mg·( L·h) - 1与 23. 78 mg·( L·h) - 1,发生在初始浓度为 250 mg·L - 1时。 当NO -3 -N 为 50、100 mg·L - 1时,混合液为碳源时的硝酸盐去除率与反硝化效率均高于玉米叶水解液为唯一碳源时,在 50 mg·L - 1时更为明显。 在 NO -3 -N≥150 mg·L - 1时,TAD1 利用玉米叶水解液的好氧反硝化性能优于柠檬酸钠。 同样地,OD600随着浓度的增加相应增大,利用玉米叶水解液为碳源的 TAD1 菌浓度始终高于利用混合液为碳源的菌浓度。 而且,当 NO -3 -N 由200 mg·L - 1增加至250 mg·L - 1,OD600的增加最为明显,利用水解液生长的菌浓度由 1. 865 增加至 2. 380,而利用柠檬酸钠的由 1. 690 增加至 2. 298。当 NO -3 -N 为 300 mg·L - 1时,两者菌浓度皆达到最大值 2. 520 及 2. 410。 这可能是因为高浓度的氮源可以刺激 TAD1 的生长,尤其当 NO -3 -N 高于 200 mg·L - 1时。 另外,玉米叶水解液为唯一碳源更能促进TAD1 的生长;因此,当 NO -3 -N≤100 mg·L - 1时,混合液更适宜作为 TAD1 的碳源,当 NO -3 -N > 100 mg·L - 1时,则玉米叶水解液更具有优势。

　　2. 6　 初始 NO --N 的影响

　　实验考察不同 NO -2 -N 对 TAD1 利用2 种碳源的好氧反硝化性能的影响,结果如图5 所示。 由图5( a)与 5( b)可看出,当以玉米叶水解液为唯一碳源时,初始 NO -2 -N 为 30 ~ 100 mg·L - 1时,亚硝酸盐均在 7. 5h 内去除。 而利用混合液作为碳源时,30 mg·L - 1NO -2 -N 在5 h 内去除,50 mg·L - 1NO -2 -N 在7. 5 h 内去除,100 mg·L - 1NO -2 -N 在 10 h 内去除。 当初始 NO -2 -N 为 150 mg·L - 1时,利用玉米叶水解液生长的TAD1 在 10 h 内去除了 56. 46% 的 NO -2 -N。 而利用混合液生长的 TAD1 在 10 h 内仅仅去除了 8. 54% 的NO -2 -N。 说明碳源不足导致好氧反硝化进行不彻底,亚硝酸盐去除率低;玉米叶水解液更适于高浓度亚硝酸盐的去除。 由图 5( c)可以看出,玉米叶水解液作为碳源时,当 NO -2 -N 高于 30 mg·L - 1,TAD1 从 0 h开始就迅速生长。 当 NO -2 -N 为 100 mg·L - 1培养 10 h 后,OD600达到最大值 1. 185,而当 NO -2 -N 为 150mg·L - 1时,培养 10 h 的 TAD1 的 OD600在 4 个浓度中最低,0. 615。 这说明了以玉米叶水解液为碳源时,NO -2 -N 为 30 ~ 100 mg·L - 1时,亚硝酸盐浓度增加并没有抑制 TAD1 的生长,反而有助于其生长。 由图 5(d)可以看出,以混合液作为碳源时,TAD1 从2. 5 h 开始迅速生长。 在初始 NO -2 -N 为100 mg·L - 1培养10 h后,OD600达到最大值 0. 922,明显低于同条件下玉米叶水解液为碳源的 OD600 。 因此,当 NO -2 -N < 50 mg·L - 1时,混合碳源更有利于 TAD1 进行好氧反硝化。 当 NO -2 -N > 50 mg·L - 1时,玉米叶水解液碳源更具有优势。

 图 5 初始 NO -2 -N 对 TAD1 分别利用玉米叶水解液( a,c) 、混合碳源( b,d)的好氧反硝化的影响

　　3　 讨论

　　3. 1　 菌株 TAD1 分别利用玉米叶水解液、柠檬酸钠为碳源时好氧反硝化性能

　　好氧反硝化需要充足的外源有机碳作为电子供体将硝酸盐还原为氮气。 农林业有机物即木质纤维素物质由于其经济性以及来源广泛,有作为反硝化碳源的巨大潜力;但是由于纤维素是由线性的葡萄糖聚合物通过氢键连接,并与半纤维素和木质素紧密结合在一起,其复杂的三维结构会阻碍微生物获得可利用的碳源,因此,先将玉米叶水解以破坏其复杂结构,使微生物更容易利用其有机碳有助于随后的反硝化反应。 水解预处理的费用相对于碳源费用要低得多。 实验证明玉米叶水解液为 TAD1 提供可利用的有机碳使其可高效进行反硝化,使 NO -3 -N 的快速还原和积累的 NO -2 -N 的快速去除,反硝化时间比以柠檬酸钠为碳源的缩短一半。 这可能是玉米叶水解后有各种各样可利用的糖类以及有机酸类碳源为微生物提供电子供体,使其代谢活动更加旺盛,在短时间内进入对数生长期,快速利用氮源达到脱氮的目的,但是其脱氮率(91. 82% )低于以柠檬酸钠为碳源(100% ) 。

　　3. 2　 培养条件对好氧反硝化的影响

　　当柠檬酸钠与玉米叶比例为 1 ∶ 4 时好氧反硝化效果最好,处理 10 h 后硝酸盐去除率达到 95. 85% ,反硝化速率为 9. 59 mg·( L·h) - 1,TAD1 同时获得最佳反硝化速率和脱氮率。 亚硝酸盐在 7. 5 h 内还原为含氮气体,少于施氏假单胞菌 Pseudomonas. stutzeri PCN-1 利用玉米淀粉为碳源时所需时间(12 h)。 有研究表明,在有好氧条件下混合碳源可以同时促进硝酸盐还原和碳的降解;因为纤维素是线性的葡萄糖聚合物,玉米叶水解液主要成分是糖类,与柠檬酸钠混合其相互作用可能更有利于 TAD1 对碳源的利

　　用,从而充分还原硝酸盐。 另外,柠檬酸钠能使周质硝酸盐还原酶活性增强,使好氧反硝化进行得更彻底。 以混合液为碳源时,最适宜 pH 为 8. 0。 这时由于 TAD1 利用含玉米叶水解液的混合碳源生长时,在胞外酶的作用下进一步将糖类分解为有机酸,使 pH 降低,偏碱性有利于补偿碳源分解带来的 pH 下降。但是,在 pH 为 7. 0 ~ 9. 0 时,去除率均高于 92. 5% ,说明 TAD1 能适应废水处理过程中的 pH 的波动,具有实际意义。

　　高浓度的 NO -3 -N 可能是反硝化的其中一个限制因素,因为剩余的碳源可能不足以维持异养代谢;但是在本实验高浓度硝酸盐反而刺激了 TAD1 的生长,增强硝酸盐还原酶的活性,促进好氧反硝化快速进行,以玉米叶水解液为碳源时尤为明显。 可能由于玉米叶水解液中含有高浓度的多种糖类从而更有利于TAD1 生长繁殖。 初始 NO -3 -N 浓度越高,NO -2 -N 的还原需要更多的时间,初始 NO -3 -N 为250 mg·L - 1时,处理 10 h 后没有亚硝酸盐存在;NO -3 -N 为 300 mg·L - 1时,处理 12 h 后没有亚硝酸盐存在。 其高效好氧反硝化性能明显优于已报道的好氧反硝化菌施氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri T13 利用丁二酸钠为碳源时的性能。 在初始 NO -3 -N 为 185. 24 mg·L - 1,摇床转速为 160 r·min - 1,T13 培养 15 h 后仍有 147. 44mg·L - 1NO -2 -N。 总的来说,当 NO -3 -N 为 30 ~ 100 mg·L - 1时,混合液更适宜作为 TAD1 的碳源,当NO -3 -N 为 150 ~ 300 mg·L - 1时,玉米叶水解液更适宜为 TAD1 提供碳源进行好氧反硝化;因此,玉米叶水解液可以作为一种高效廉价的碳源处理高浓度硝酸盐废水。

　　催化还原亚硝酸盐为含氮气体的亚硝酸还原酶通常是对氧气敏感的;但是在初始 NO -2 -N 为 100mg·L - 1,摇床转速为 160 r·min - 1条件下,TAD1 利用玉米叶水解液为碳源,NO -2 -N 在 7. 5 h 内完全去除。 说明当玉米叶水解液为碳源时,TAD1 的亚硝酸还原酶在较高溶解氧下也能高效运作。 玉米叶水解液为碳源时,适当增加亚硝酸盐的初始浓度可以加速 TAD1 的生长,但当 NO -2 -N 为150 mg·L - 1,TAD1 的生长受到抑制,可能由于此时碳源已经不能为 TAD1 提供大量的电子供体。 当 NO -2 -N 为30、50 mg·L - 1,以混合液为碳源时,NO -2 -N 分别在 5、7. 5 h 内被迅速还原,因此混合液适合在此浓度范围内作为 TAD1 的碳源。 当 NO -2 -N 为 50 ~ 150 mg·L - 1,利用玉米叶水解液为碳源时的好氧反硝化性能更佳。

　　4　 结论

　　1)初始 NO -3 -N 为 100 mg·L - 1时,柠檬酸钠与玉米叶水解液比例为 1 ∶ 4 时可获得最佳的好氧反硝化性能,TAD1 培养 10 h 后硝酸盐去除率达到 95. 85% 。 其最佳 pH 为 8. 0,适宜范围为 7. 0 ~ 9. 0。

　　2)初始 NO -3 -N 在 50 ~ 250 mg·L - 1的范围内,脱氮率、反硝化效率与时间成正相关,脱氮率最高达到97. 20% ,反硝化效率最高为 24. 30 mg·( L·h) - 1。 NO -3 -N 为 30 ~ 100 mg·L - 1时,混合液更适宜作为TAD1 的碳源,当 NO -3 -N 为 150 ~ 300 mg·L - 1时,玉米叶水解液更合适。

　　3)适当增加亚硝酸盐的初始浓度可以加速 TAD1 的生长,但当 NO -2 -N 为 150 mg·L - 1,TAD1 的生长受到抑制。 NO -2 -N 为 30 ~ 50 mg·L - 1时,混合液更适宜作为 TAD1 的碳源,当 NO -2 -N 为 50 ~ 150 mg·L - 1时,玉米叶水解液更合适。